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Omega去内毒素质粒提取试剂盒操作说明

关 键 词
Omega,质粒DNA试剂盒
资料类型
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2020年03月24日 17:07
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上海古朵生物科技有限公司
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资料简介

  该试剂盒用于从克隆菌中大量提取去除内毒素的高品质质粒,一般来说可从200ml过夜培养的菌液中提取高拷贝质粒600-1200ug,低拷贝质粒50-400ug。试剂盒自带的说明书为英文说明书,不是非常方便阅读,所以本文根据英文原版重新翻译了一遍,希望对大家有帮助。
 
  实验前准备
 
  1. 使用前,将RNase A全部加入Solution I中并于4度保存。
 
  2. 按下表用无水乙醇稀释DNA Wash Buffer,并于室温保存。
 
  试剂盒型号    加入的乙醇量(ml)
 
  D6926-00B    60
 
  D6926-01B    160
 
  D6926-03B    200
 
  D6926-04B    200每瓶
 
  细菌的培养:
 
  1. 在容积为1-4升的培养瓶中加入200ml含筛选抗生素的LB培养基,加入含目的质粒的克隆菌(一般为1/1000比例接种,也即200ul),然后置37℃振荡培养12-16小时。为了获得zui佳的效果,推荐接菌使用经过夜培养活化的菌种。对于大多数质粒的提取,我们强烈推荐使用endA阴性的菌种,比如DH5α和JM109。
 
  zui佳的培养条件对于质粒DNA的得率至关重要。zui佳的培养条件包括,首先由新转化或新划线的培养板中挑取单个克隆,然后接种于2-5ml含合适筛选抗生素的培养基中,37℃振荡(摇床转速设定在约300rpm为宜)培养约8小时;然后继续接种于含抗生素的预热的液体培养基中,37℃振荡(~300rpm)培养12-16小时。盛培养基的容器的容积需至少为培养基体积的3-4倍(注:保证培养环境中有足够的氧气,防止厌氧菌的繁殖),初始培养基接种的稀释比例为1/500到1/1000为宜。
 
  为了获得zui佳的效果,我们推荐每次培养后测定OD600值。对于过夜培养活化的细菌而言,OD600的值处于1.5-2.0之间是细菌生长良好的指标。在测定OD600时,为了保证测量值处于光度计测量的线性范围(0.1-0.5),需将培养物进行必要的稀释(10到20倍)。当接种进行大量培养时,我们推荐细菌的终密度在2.0-3.0之间为宜。当使用富营养的培养基,需要注意保证细菌的密度不要超过OD600为3.0;如果使用冻存的甘油菌,需要首先进行划线并挑取单克隆,然后和前面一样进行必要的活化。
 
  富营养培养基如2xYT或TB,不推荐使用本试剂盒。
 
  碱性-SDS溶液裂解细菌:
 
  2. 取100-200ml菌液3,500-5,000xg室温离心10min收集菌体沉淀。
 
  3. 小心去除上清液,为了保证所有上清去除完全,可使用干净的纸巾将容器壁上液滴吸除,加10ml Solution Ⅰ/RNase A , 涡旋或用移液枪上下吹打重悬菌体,重悬完全对于获得zui高的得率至关重要;
 
  4. 加10ml SolutionⅡ,来回颠倒10-15次轻柔混匀,以得到澄清的裂解液。如有必要可室温孵育2min。
 
  避免混合时动作过于剧烈,过于剧烈会剪切细菌的染色体DNA(从而在接下来的步骤中不能被充分沉淀)并且导致质粒的纯度降低。(当Solution II在不使用时,需要将瓶盖旋紧,防止空气中的CO2与Solution II反应生成碳酸盐)
 
  5. 加5ml Buffer N3,轻轻颠倒充分混匀几次直至白色絮状沉淀出现。室温放置2—3min,期间偶尔颠倒混合,以使其充分反应。
 
  注意:该溶液必须充分混合。如果混合物依然非常的粘滞,呈褐色并且成团状,则需要进一步混合以充分中和该溶液,充分中和对于获得更好的得率至关重要。使用冰预冷的Buffer N3将有利于沉淀更多的细菌蛋白。
 
  6. 准备结合柱:加5ml的Buffer GPS至结合柱中,室温放置3—10min,3,000—5,000×g室温离心5min,弃滤液(注:这里中文说明书中添加了一步“往柱子里加入10ml无菌水离心弃滤液”,而在英文原版中是没有的),把柱子插回50ml收集管中。(注:这里可以使用一个旧的50ml离心管收集废液,而将试剂盒中附带的新离心管用于zui后一步质粒洗脱时使用)。
 
  使用针筒式过滤器过滤裂解物:
 
  7. 将第5步得到的裂解液及沉淀物全部转移至针筒式过滤器中,准备一个干净的50ml离心管收集滤液。将过滤器的活塞插回针筒。
 
  8. 将针筒对准50ml收集管,轻轻推动活塞,收集澄清的滤液。一些裂解液中可能仍然残留有絮状沉淀物,不要强行将这些残留的裂解液推挤过柱。
 
  9. 加入等体积的ETR Binding Buffer(~25ml)到结合柱上,上下反复颠倒7-10次。
 
  使用HiBind结合柱纯化质粒DNA(注:离心法,适用于同时抽提多个样品,对于样本量较少时,推荐使用后面的真空抽滤法)
 
  10. 小心转移裂解液至HiBind结合柱,3,000—5,000×g离心3—5min,使液体滤过柱子,弃滤液。
 
  11. 重复步骤10,直至所有裂解液都过滤完,弃滤液。
 
  12. 加入10ml ETR Wash Buffer到结合柱上,3,000—5,000×g离心3—5min,使全部液体滤过柱子,弃滤液。
 
  13. 加入10ml Buffer EHB到结合柱上,3,000—5,000×g离心3—5min使全部液体滤过柱子,弃滤液。
 
  14. 加入15ml DNA Wash Buffer(预先添加了乙醇)到结合柱上,3,000—5,000×g离心3—5min使全部液体滤过柱子,弃滤液;
 
  注意:试剂盒附带的DNA Wash Buffer在使用之前必须按标签的提示用无水乙醇稀释。如果试剂是低温保存的,使用前需要预先恢复温度至室温。
 
  15. 加入10ml DNA Wash Buffer到结合柱上3,000—5,000×g离心3—5min使全部液体滤过柱子,弃滤液;
 
  16. 把空柱子套回离心管,zui大转速(不超过6,000×g)离心10—15min使柱子充分干燥。不要跳过该步骤-该步对于去除柱子中残留的乙醇非常关键。
 
  使用HiBind结合柱纯化质粒DNA(注:真空抽滤法,对于样品个数较少时,该方法比较节省时间)
 
  10. 安装好抽滤装置,将结合柱与抽滤瓶密闭结合
 
  11. 转移裂解液至HiBind结合柱,使液体全部滤过柱子。
 
  12. 加入10ml ETR Wash Buffer到结合柱上,洗涤一次(注:流速可能会比较慢)。
 
  13. 加入10ml Buffer EHB到结合柱上,洗涤一次。
 
  14. 加入15ml DNA Wash Buffer(预先添加了乙醇)到结合柱上,洗涤一次。
 
  15. 再次加入10ml DNA Wash Buffer,洗涤一次。
 
  16. 继续抽真空10-15min,以充分干燥结合柱(注:当抽提多个样品时,可以选择离心法步骤16中的方法以节约时间)。
 
  由结合柱洗脱质粒DNA(常规方法,也可以使用后面介绍的另一种洗脱方法)
 
  17. 进一步干燥柱子:选择以下任一种方法在洗脱前进一步干燥结合柱
 
  A. 将结合柱转移真空抽滤装置上室温抽滤15min
 
  B. 将结合柱放入65℃恒温烤箱,烘烤10—15min
 
  18. 把结合柱套在一个新的50ml离心管中(注:可以使用试剂盒附带的离心管),加入1—3ml(注:依据要求的质粒终浓度,可以分步两次洗脱,第1次少量洗脱保证得到高浓度的质粒,第二次稍加大洗脱体积,保证尽可能将质粒洗脱完全) Endotoxin-Free Elution Buffer(或去离子水)至结合柱的膜上,室温放置2—5min,以zui高转速离心(不超过6,000xg)5min洗脱质粒DNA。
 
  上面描述的方法可以回收大约60-80%柱结合的DNA。也可以选择进行二次洗脱从而将所有残留的DNA全部回收,但二次洗脱的DNA浓度会低一些。另外,第二次洗脱也可以使用首次洗脱下来的液体以保证得到较高浓度的质粒DNA。将洗脱液或去离子水预热至70℃并且在洗脱前,室温放置2min,可能会显著提升zui终的得率。
 
  注意:使用该方法得到的质粒可以很好的应用与PCR,限制性酶切,脂质体转染等。预期的质粒浓度可能依据质粒的拷贝数不同存在一些出入。但是,一般来说高拷贝的质粒终浓度在150-600ug/ml。该方法得到的质粒可能会包含一些乙醇残留,但一般不会影响下游实验。如果需要获得更高的质粒浓度和完全去除乙醇残留,可以选择使用下面的方法。
 
  另一种结合柱洗脱质粒DNA的方法
 
  1. 把结合柱套在一个新的50ml离心管中(注:可以使用试剂盒附带的离心管),加入6ml Endotoxin-Free Elution Buffer(或去离子水)至结合柱的膜上,室温放置2min,以zui高转速离心(不超过6,000xg)5min以洗脱质粒DNA。将洗脱液或去离子水预热至70℃并且在洗脱前,室温放置2min,可能会显著提升zui终的得率。
 
  2. 将洗脱的质粒DNA转移到一个干净的适用于沉淀的离心管中。加入260ul 5M NaCl以及4.4ml室温放置的异丙醇。涡旋以充分混匀,然后以不低于15,000×g转速4℃离心30min。小心地去除上清。
 
  3. 用2ml 70%的乙醇洗涤沉淀一次,以不低于15,000×g转速4℃离心10min,小心地去除上清。空气干燥沉淀5-10min。
 
  4. 加入200-500ul(依据要求的质粒终浓度)Endotoxin-Free Eluiton Buffer或去离子水重悬DNA。

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